BPatG Urteil vom 14.09.2021 – 3 Ni 30/19 (EP)

BUNDESPATENTGERICHT

IM NAMEN DES VOLKES

3 Ni 30/19 (EP)

(Aktenzeichen)

Verkündet am

14. September 2021

…

In der Patentnichtigkeitssache

…

ECLI:DE:BPatG:2021:140921U3Ni30.19EP.0

betreffend das europäische Patent 1 530 578

(DE 603 43 525)

hat der 3. Senat (Nichtigkeitssenat) des Bundespatentgerichts aufgrund der

mündlichen Verhandlung vom 14. September 2021 durch den Vorsitzenden

Richter Schramm, den Richter Schwarz, die Richterin Dipl.-Chem. Dr. Münzberg

und die Richter Dipl.-Chem. Dr. Jäger und Dipl.-Chem. Dr. Freudenreich

für Recht erkannt:

I. Die Klage wird abgewiesen.

II. Die Klägerin trägt die Kosten des Rechtsstreits.

III. Das Urteil ist gegen Sicherheitsleistung in Höhe von

120 % des zu vollstreckenden Betrages vorläufig

vollstreckbar.

T a t b e s t a n d

Die Beklagte ist eingetragene Inhaberin des mit Wirkung für das Hoheitsgebiet der

Bundesrepublik Deutschland in der englischen Verfahrenssprache erteilten und

nach europäischem Einspruchsverfahren wie erteilt aufrechterhaltenen

europäischen Patents 1 530 578 (Streitpatent), das am 22. August 2003 unter

Inanspruchnahme der Prioritäten

einer US-amerikanischen Anmeldung

US 227131 vom 23. August 2002 und zweier britischer Anmeldungen GB 0230037

vom 23. Dezember 2002 und GB 0303924 vom 20. Februar 2003 angemeldet

worden ist. Das beim Deutschen Patent- und Markenamt unter dem Aktenzeichen

DE 603 43 525.4 geführte Streitpatent

trägt die Bezeichnung „MODIFIED

NUCLEOTIDES FOR POLYNUCLEOTIDE SEQUENCING”

(in Deutsch laut

Streitpatentschrift:

„MODIFIZIERTE

NUKLEOTIDE

FÜR

POLYNUKLEOTIDSEQUENCING“) und umfasst 30 Patentansprüche, von denen

die Patentansprüche 1, 12, 17, 25, 28, 29 und 30 nebengeordnet und die übrigen

Patentansprüche

jeweils

unmittelbar

oder mittelbar

auf

einen

der

nebengeordneten Patentansprüche zurückbezogen sind.

Die nebengeordneten Patentansprüche 1, 12, 17, 25, 28, 29 und 30 lauten in der

Verfahrenssprache wie folgt:

1.

A modified nucleotide molecule comprising a purine or pyrimidine base and a ribose or

deoxyribose sugar moiety having a removable 3’-OH blocking group covalently

attached thereto, such that the 3’ carbon atom has attached a group of the structure

-O-Z

wherein Z is any of -C(R’)2-N(R")2’C(R’)2-N(H)R", and -C(R’)2-N3, wherein each R" is or

is part of a removable protecting group; each R’ is independently a hydrogen atom, an

alkyl, substituted alkyl, arylalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, heterocyclic, acyl,

cyano, alkoxy, aryloxy, heteroaryloxy or amido group, or a detectable label attached

through a linking group; or (R’)2 represents an alkylidene group of formula =C(R’’’)2

wherein each R’’’ may be the same or different and is selected from the group

comprising hydrogen and halogen atoms and alkyl groups; and wherein said molecule

may be reacted to yield an intermediate in which each R’’ is exchanged for H, which

intermediate dissociates under aqueous conditions to afford a molecule with a free

3‘OH.

12.

A method of controlling the incorporation of a nucleotide as defined in any one of

claims 6 to 10 and complementary to a second nucleotide in a target single-stranded

polynucleotide in a synthesis or sequencing reaction comprising incorporating into the

growing complementary polynucleotide said nucleotide, the incorporation of said

nucleotide preventing or blocking introduction of subsequent nucleoside or nucleotide

molecules into said growing complementary polynucleotide.

17.

A method for determining the sequence of a target single-stranded polynucleotide,

comprising monitoring the sequential incorporation of complementary nucleotides,

wherein at least one incorporation is of a nucleotide as defined in any one of claims 6

to 10 and wherein the identity of the nucleotide incorporated is determined by

detecting the label linked to the base, and the blocking group and said label are

removed prior to introduction of the next complementary nucleotide.

25.

A kit, comprising:

(a) a plurality of different nucleotides wherein said plurality of different nucleotides are

either as defined in any one of claims 6 to 10; and

(b) packaging materials therefor.

28. Use of a nucleotide as defined in any one of claims 1 to 11 in a Sanger or a Sangertype sequencing method.

29. An oligonucleotide comprising a modified nucleotide of claims 1-11.

30. A nucleotide triphosphate comprising a modified nucleotide of claims 1-11.

In deutscher Sprache haben sie laut Streitpatentschrift folgenden Wortlaut:

1.

Modifiziertes Nucleotidmolekül, umfassend eine Purin- oder Pyrimidinbase und eine

Ribose- oder Desoxyribose-Zuckereinheit mit einer kovalent daran gebundenen,

entfernbaren, 3’-OH-blockierenden Gruppe, so dass an dem 3’-Kohlenstoffatom eine

Gruppe der Struktur

-O-Z

gebunden ist, wobei es sich bei Z um eines von -C(R’)2-N(R’’)2, -C(R’)2-N(H)R’’ und -

C(R’)2-N3 handelt, wobei es sich bei jedem R’’ um eine entfernbare Schutzgruppe oder

einen Teil davon handelt; es sich bei jedem R’ unabhängig um ein Wasserstoffatom,

eine Alkyl-, substituierte Alkyl-, Arylalkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Heteroaryl-,

heterozyklische, Acyl-, Cyano-, Alkoxy-, Aryloxy-, Heteroaryloxy- oder Amido-Gruppe

oder eine durch eine verknüpfende Gruppe gebundene nachweisbare Markierung

handelt; oder (R‘)2 eine Alkylidengruppe der Formel =C(R’’’)2 darstellt, wobei jeder R’’’

gleich oder unterschiedlich sein kann und aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend

Wasserstoff- und Halogenatome und Alkylgruppen; und wobei das Molekül umgesetzt

werden kann, um ein Zwischenprodukt zu ergeben, bei welchem jeder R’’ gegen H

ausgetauscht ist, wobei dieses Zwischenprodukt unter wässrigen Bedingungen

dissoziiert, um ein Molekul mit einem freien 3’-OH zu hervorzubringen.

12.

Verfahren zum Kontrollieren des Einbaus eines wie in einem der Ansprüche 6 bis 10

definierten und zu einem zweiten Nucleotid

in einem einzelsträngigen Ziel-

Polynucleotid

komplementären

Nucleotids

bei

einer

Synthese

oder

Sequenzierreaktion, umfassend das Einbauen des Nucleotids in das wachsende

komplementäre Polynucleotid, wobei der Einbau des Nucleotids die Einführung

darauffolgender Nucleosid- oder Nucleotidmolekule in das wachsende komplementäre

Polynucleotid verhindert oder blockiert.

17.

Verfahren zum Bestimmen der Sequenz eines einzelsträngigen Ziel-Polynucleotids,

umfassend das Überwachen des aufeinanderfolgenden Einbaus komplementärer

Nucleotide, wobei es sich bei mindestens einem Einbau um den eines wie in einem

der Ansprüche 6 bis 10 definierten Nucleotids handelt und wobei die ldentität des

eingebauten Nucleotids durch Nachweisen der mit der Base verknüpften Markierung

bestimmt wird und die blockierende Gruppe und die Markierung vor der Einführung

des nächsten komplementären Nucleotids entfernt werden.

25.

Kit, umfassend

(a) eine Vielzahl unterschiedlicher Nucleotide, wobei es sich bei der Vielzahl

unterschiedlicher Nucleotide jeweils um die in einem der Ansprüche 6 bis 10

definierten handelt, und

(b) Verpackungsmaterialien dafür.

28.

Verwendung eines Nucleotids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 definiert, bei

einem Sanger-Sequenzierverfahren oder einem Sequenzierverfahren der Sanger-Art.

29. Oligonucleotid, umfassend ein modifiziertes Nucleotid nach den Ansprüchen 1 - 11.

30.

Nucleotidtriphosphat, umfassend ein modifiziertes Nucleotid nach den Ansprüchen 1 -

11.

Mit ihrer Nichtigkeitsklage begehrt die Klägerin die vollständige Nichtigerklärung

des Streitpatents, weil dessen Gegenstand mangels erfinderischer Tätigkeit nicht

patentfähig sei. Hierzu hat sie u.a.

folgende Druckschriften eingereicht

(Nummerierung und Kurzzeichen von der Klägerin):

NiK1

NiK7

NiK10

NiK11

NiK12

EP 1 530 578 B1 (Streitpatent)

METZKER, M.L. et al., Nucleic Acids Research, 1994, 22(20),

S. 4259-4267

WO 91/06678 A1

WO 02/29003 A2

US 5 763 594 A

NiK15

GOLOLOBOV, Y.G. und KASUKHIN, L.F., Tetrahedron, 1992,

48(8), S. 1353-1406

NiK16

POLUSHIN, N.N. et al., Tetrahedron Letters, 1996, 37(19),

S. 3227-3230

NiK17

GREENE, T.W. und WUTS, P.G.M. [Hrgs.], Protective Groups

in Organic Synthesis, 1999, Third Ed., Wiley, New York, S. iiixxi, 1-293, 494-503, 578-581, 700-779 – ISBN 0-471-16019-9

NiK20

CANARD, B. et al., Procedures of Natural Academic Science

USA, 1995, 92, S. 10859-10863

NiK26

ZAVGORODNY, S. et al., Tetrahedron Letters, 1991, 32(51),

S. 7593-7596

NiK27

ZAVGORODNY, S.G. et al., Nucleosides, Nucleotides and

Nucleic Acids, 2000, 19(10-12), S. 1977-1991

NiK46

OKSMAN, P. et al., Journal of Physical Organic Chemistry,

1992, 5, S. 741-747

NiK64

OIVANEN, M. et al., Collection of Czechoslovak Chemical

Communications, 1990, 55 (Special Issue), S. 17-20

NiK68

STREITWIESER, A. et al., Organische Chemie, 2. Aufl., 1994,

VCH Weinheim, S. 385-386, 400-407, 760-761 – ISBN 3-527-

29005-2

NiK69

CLAYDEN, J.P. et al., Organic Chemistry, Reprint 2001, Oxford

University Press, Oxford, S. 437-438 – ISBN 0-19-850346-6

Die Klägerin trägt vor, dass ein Team aus einem Organischen Chemiker, der mit

der Nukleotidsynthese befasst sei und über vertiefte Kenntnisse bezüglich

Schutzgruppen und deren Abspaltung verfüge, und einem Biochemiker, der

Wissen zur Substratakzeptanz der Polymerase beitrage, vor der eigentlichen

technischen Aufgabe, 3’-modifizierte Nukleotide mit weiteren Blockiergruppen

bereitzustellen, die je nach Einsatzgebiet für das SBS-Verfahren (sequencing-bysynthesis), Sanger-ähnliche Sequenzierverfahren oder bloße DNA-Synthese

geeignet seien,

im Lichte des aufgezeigten Standes der Technik ohne

erfinderisches Zutun zu den Nukleotiden des Streitpatents sowie deren

Anwendung gelange.

Was die Anwendung der geschützten Nukleotide im SBS-Verfahren betreffe,

ergäben sich aus dem Anforderungskatalog der NiK10 bzw. insbesondere der

NiK11 Auswahlkriterien

für von den meisten Polymerasen akzeptierte 3’-

Schutzgruppen, nämlich eine kleine Blockiergruppe mit ähnlicher Größe wie MOM

(„Methoxymethyl“) oder Allyl sowie der Ausschluss von Methoxy als Schutzgruppe

und von Schutzgruppen mit Elektrophilen wie Ester- oder Ketongruppen. Von

NiK11 ausgehend hätte der Fachmann die NiK17 herangezogen, welche sich mit

gängigen Schutzgruppen für aliphatische und aromatische Alkohole befasse. Da

dieses Kompendium Schutzgruppen für aromatische Alkohole nicht als prinzipiell

untauglich

für

aliphatische Alkohole angebe, die pKs-Werte beider

Verbindungsklassen überlappten und ohnehin nur wenige Schutzgruppen das

Kriterium der NiK11 erfüllten, wäre er ohne erfinderische Tätigkeit auf die dort

angegebene Azidomethyl-Schutzgruppe gestoßen. Zu dem gleichen Ergebnis

führe auch die Kombination der NiK11 mit NiK16. Nukleotide würden nach

Standardverfahren und auch gemäß NiK11 aus den entsprechenden Nukleosiden

gewonnen und fachbekannt zu Polynukleotiden wie DNA und RNA polymerisiert.

Daher ziehe der Fachmann Literatur zu ihm als Nukleotid-Vorläufer bekannten 3’-

geschützten Nukleosiden wie NiK26/27 heran. Weiter wisse er auch um die

antivirale Wirkung 3’-geschützter Nukleoside als prodrug und erkenne durch den

Hinweis auf potential antivirals

in NiK26/27 und denselben bekannten

Wirkmechanismus den Zusammenhang zwischen 3’-blockierten Nukleosiden und

Nukleotiden als Terminatoren der DNA-Synthese. Folglich werde er in nicht

erfinderischer Weise ein nach NiK26/27 als tauglich befundenes Nukleosid in die

5’-Phosphat-Verbindung überführen. Auch wenn in NiK26/27 kein Hinweis auf den

Einsatz der dort beschriebenen geschützten Nukleoside bei der enzymatischen

DNA-Synthese oder Sequenzierverfahren gegeben werde, hätte der Fachmann

eine insoweit angemessene Erfolgserwartung gehabt. Denn Allyl, MOM und

Azidomethyl

seien von vergleichbarer Länge, Flexibilität und sterischer

Ausprägung, wonach ihm beim Vergleich mit MOM und Allyl aus NiK11 nur vier in

NiK26/27 gezeigte Schutzgruppen verblieben wären, von denen NiK26 die

Azidomethylgruppe als of special

interest herausstelle. Anders als eine

Estergruppe sei die Azidomethylgruppe auch nicht empfindlich

für einen

nukleophilen Angriff aus dem Zentrum der Polymerase und zudem um mehrere

Bindungslängen von diesem entfernt. Schließlich seien auch die in NiK26/27

angegebenen Entschützungsbedingungen gutachtlich mehrerer Druckschriften

DNA-kompatibel.

Vor dem Hintergrund des Stoffanspruchs 1 seien hinsichtlich der Eignung 3’-

geschützter Nukleotide

für nahe

liegende Einsatzzwecke unterschiedliche

Ausgangspunkte separat zur Prüfung auf erfinderische Tätigkeit heranzuziehen,

wobei sich aus dem aufgezeigten Stand der Technik das SBS-Verfahren, die

Sanger-Sequenzierung,

antivirale Mittel

sowie

matrizenunabhängige

Sequenzierverfahren ergäben. Bei potenziell antiviralen Mitteln belaufe sich die

Anzahl der in NiK7, NiK27, NiK46 und NiK64 genannten Verbindungen auf 23 und

die 3’-Azidomethylgruppe sei in drei dieser vier Dokumente angegeben, so dass

der Fachmann diese besonders beachtet und im Zuge dessen auch das

entsprechende Nukleotid hergestellt hätte. Auch für das Sanger-Verfahren hätte er

diese Verbindungen im Lichte der NiK7 herangezogen, da NiK7 3’-geschützte

Nukleotide sowohl im Sanger-Verfahren teste, als auch einen Bezug zu antiviralen

Mitteln herstelle und zur Herstellung weiterer blockierter Nukleotide motiviere.

Zwar nenne NiK12 für das matrizenunabhängige Sequenzierverfahren eine große

generische Anzahl an Nukleotiden, beschreibe aber in den Beispielen konkret nur

eine geringe Zahl und rate von Estern ab, wonach der Fachmann dort genannte

Ether,

insbesondere den (substituierten) Ethoxyethylether beachte und

in

Verbindung mit NiK7, NiK27, NiK46 und NiK64 zu einer überschaubaren Anzahl

solcher Schutzgruppen gelange, selbst wenn er diejenigen aus NiK12 abziehe

oder die aus NiK26 hinzufüge.

Die Klägerin beantragt,

das europäische Patent EP 1 530 578 mit Wirkung

für das

Hoheitsgebiet der Bundesrepublik Deutschland für nichtig zu

erklären.

Die Beklagte beantragt,

die Klage abzuweisen.

Zur Stützung ihres Vorbringens hat die Beklagte u.a. folgende Druckschrift

eingereicht:

rop6

CHRISTENSEN, L.F. und BROOM, A.D., Journal of Organic

Chemistry, 1972, 37(22), S. 3398-3401

Nach Ansicht der Beklagten ist der Gegenstand des Streitpatents schutzfähig.

Denn hinsichtlich der Kombination NiK11 mit NiK17 identifiziere NiK11 keine

„kleinen“ Schutzgruppen oder schränke diese strukturell ein, sondern schließe

vielmehr Elektrophile als Blockiergruppen für die 3’-OH Position aus, wonach die

Lehre der NiK11 „für bare Münze“ zu nehmen sei. Soweit der Fachmann nach

Alternativen

für die in NiK11 genannten MOM- und Allylgruppen suche,

beschränke er sich auf die in NiK17 genannten Schutzgruppen für aliphatische

Hydroxylgruppen und ziehe solche für aromatische Hydroxylgruppen nicht in

Betracht. Zudem sei die Azidomethylgruppe stark elektrophil, ungeeignet für die

beengten sterischen Verhältnisse im Zentrum der Polymerase und werde nach

NiK11 nur unter für SBS ungeeigneten Bedingungen mit unzureichenden

Ausbeuten reduziert. NiK26/27 würde der Fachmann von NiK11 ausgehend nicht

beachten, da sich diese mit Nukleosid-Analoga beschäftigten, die Polymerasebasierten Verfahren nicht zugänglich seien. Auch würden große Mengen an bei

DNA denaturierend wirkendem Pyridin zur Entschützung benötigt, und dies bei

niedriger Entschützungsrate. Die seitens der Klägerin angeführte Kombination

NiK11 und NiK16 scheitere bereits daran, dass NiK16 keine enzymatisch geführte

Dimerbildung von Nukleotiden, sondern eine solche mittels organischer Synthese

betreffe und auch keine Azidomethylgruppe offenbare, sondern eine Azidgruppe.

Gleichermaßen bildeten NiK26/27 aus fachlicher Sicht keinen Ausgangspunkt für

die patentgemäße Lehre, da dort von Nukleotiden keine Rede sei und die Vielzahl

der dort beschriebenen Blockiergruppen nur dem Zweck der Herstellung

modifizierter Nukleoside diene. Die mit antiviralen Verbindungen befasste NiK46

weise nur einigen der dort behandelten Verbindungen Aussicht auf antivirale

Wirksamkeit zu. Das 3’-Azidomethyl-Ribonukleosid erfahre darin jedoch keine

besondere Aufmerksamkeit. Nukleotide seien ohnehin als Virus-Inhibitoren

ungeeignet, da sie nicht in die Zellen dringen könnten, und eine „in vivo“-

Phosphorylierung sei gutachtlich der bekannten wissenschaftlichen Literatur

unvorhersehbar. NiK7 rege den Fachmann nicht dazu an, sich der Literatur von

antiviral wirkenden Mitteln, wie den bereits diskutierten Nukleosiden der NiK46,

zuzuwenden, sondern gebe sieben Arten 3’-modifizierter Verbindungen an, von

denen nur drei eine Terminierungsaktivität aufwiesen. Für die Kombination von

NiK12 mit NiK17 würden dieselben Überlegungen gelten wie für die Kombination

von NiK11 mit NiK17. Schließlich führe auch die Kombination der NiK12 mit

NiK26/27 nicht zur Lehre des Streitpatents, da diese Druckschriften in dem

unterschiedlichem technischen Kontext der organischen Synthese und der

enzymatischen Verfahren angesiedelt seien und somit keine Kombination

veranlassten. Auf die in der Sache ähnliche Einschätzung des Europäischen

Patentamts bei der vergleichbaren Lehre in EP 3 002 289 werde hingewiesen.

E n t s c h e i d u n g s g r ü n d e

Die zulässige Klage ist unbegründet, da der geltend gemachte Nichtigkeitsgrund

der mangelnden Patentfähigkeit (Artikel II § 6 Abs. 1 Nr. 1 IntPatÜG i.V.m. Art. 138

Abs. 1 lit. a) und Art. 56 EPÜ nicht besteht.

I.

1.

Das Streitpatent (NiK1) betrifft modifizierte Nukleotide, insbesondere solche

mit entfernbarer Schutzgruppe an der 3’-Position der (Desoxy)Riboseeinheit des

Nukleotids, deren Verwendung bei der Sequenzierung von Polynukleotiden, sowie

ein Verfahren zur chemischen Entfernung der Schutzgruppe (NiK1 [0001], [0018]).

Zum Prioritätszeitpunkt

seien

bereits

verbesserte Technologien

zur

Sequenzanalyse von Polynukleotiden (DNA, RNA) bekannt gewesen (NiK1

[0002]), z.B. eine effizientere Handhabung von Polynukleotiden als Matrix hoher

Dichte, immobilisiert auf einem festen Träger (NiK1 [0003]). Aufbauend auf dem

Sanger-Verfahren (NiK1 [0083]) seien neuere Methoden zur DNA-Sequenzierung

wie das sequencing-by-synthesis (SBS) Verfahren entwickelt worden (NiK1

[0004]), das nach der im Absatz [0007] des Streitpatents zitierten Quelle NiK7

auch als Base Addition Sequencing Scheme (BASS) bezeichnet wird. Nach dem

SBS-Verfahren würden Nukleotide in einen neu zu synthetisierenden DNA-Strang

eingebaut, wobei das Nukleotid komplementär zum jeweiligen Nukleotid an der

entsprechenden Position im zu sequenzierenden DNA-Strang sei. Mittels des

Enzyms Polymerase werde die 5'-Position des neu einzubauenden Nukleotids

über eine Phosphatgruppe mit der freien 3'-OH-Gruppe des zuletzt eingebauten

Nukleotids im bereits synthetisierten Oligonukleotid-Strang verbunden, dadurch

kontrolliert, dass nach jedem Nukleotid-Einbau die DNA-Neusynthese zunächst

unterbrochen werde, um die zuletzt eingebaute Nukleotid-Base anhand einer

spezifischen Markierung, wie einem

für die

jeweilige Base spezifischen

Fluoreszenz-Farbstoff, der über eine spaltbaren Linker mit dem Nukleotid

verbunden sei, zu identifizieren. Dann werde der Zyklus fortgesetzt. Die

kontrollierte Unterbrechung der Oligonukleotidverlängerung werde durch die an

der 3'-Position der

(Desoxy)Ribose-Einheit des Nukleotids vorgesehene

Schutzgruppe realisiert, die unter geeigneten Bedingungen wieder abspaltbar sei.

Somit werde nach Identifizierung der zuletzt eingebauten Nukleotid-Base die 3'-

Schutzgruppe wieder abgespalten bzw. „entschützt“ und bei diesem Vorgang auch

die Markierung entfernt, indem der bekannte linker gespalten werde (NiK1 [0005]

i.V.m. [0031-0042], [0090-0091] cleavable linker).

2.

Die im Streitpatent nicht ausdrücklich formulierte Aufgabenstellung besteht

auf der Basis des dargestellten Stands der Technik i.V.m. mit den Stoff- und

Erzeugnisansprüchen 1, 25, 29 und 30 sowie deren Einsatzzwecken nach den

Ansprüchen 12, 17 und 28 in der Bereitstellung von Nukleotiden mit einer

Schutzgruppe für die 3’-OH-Gruppe, welche für Sequenzierungsverfahren und

insbesondere für das SBS-Verfahren geeignet sind. Soweit mit Patentanspruch 28

Sanger-Sequenzierverfahren

oder Sequenzierverfahren

der Sanger-Art

beansprucht sind, ist bei diesen keine Abspaltung der Schutzgruppe notwendig.

Ähnliches gilt für das sich aus Patentanspruch 12 herleitende, im Zusammenhang

mit der Sequenzierung als gleichrangig beanspruchte Syntheseverfahren.

Hinsichtlich der Schutzgruppen könne es sich auch um vorbekannte

Schutzgruppen handeln, die bei der DNA-Sequenzierung noch nicht zur

Anwendung gekommen seien (NiK1 [0013]), wonach das Streitpatent eine Suche

nach bisher nicht genutzten Schutzgruppen nicht zur Aufgabe macht; hinsichtlich

geeigneter Polymerasen für die enzymatische Verlängerung des DNA-Oligomers

verweist das Streitpatent auf bekannte, einschließlich gentechnisch modifizierte

Enzyme (NiK1 [0106]).

Entgegen der Auffassung der Klägerin, die eine weiter gefasste Aufgabe als

objektiv angezeigt erachtet, nämlich die Bereitstellung von 3’-modifizierten

Nukleotiden mit weiteren Blockiergruppen, die je nach Einsatzgebiet für SBS,

Sanger-ähnliche Sequenzierverfahren oder bloße DNA-Synthese geeignet seien,

lässt der Umstand, dass die Schutzgruppen bei einigen der beanspruchten

Einsatzzwecke nicht zwingend entfernt zu werden brauchen, nicht den Schluss zu,

dass sich die streitpatentgemäße Aufgabe auf jede beliebige Schutzgruppe

erstreckt, und damit auch auf solche, die die vorgesehene Eigenschaft einer

Abspaltung ohne DNA-Schädigung nicht zu erfüllen vermögen.

3. Mit der streitpatentgemäßen Aufgabenstellung ist ein Team befasst, dem

sowohl ein Chemiker mit Studienschwerpunkt Organische Chemie und

Hochschulabschluss angehört, der einige Jahre Praxis in der chemischen

Industrie besitzt, als auch ein Chemiker mit Studienschwerpunkt Biochemie und

Hochschulabschluss, welcher über praktische Erfahrung mit klassischen und

neueren DNA-Sequenzier- und Syntheseverfahren verfügt und an welchen sich

der Organische Chemiker zu Fragen der Hydrolysebedingungen und der Eignung

von Schutzgruppen bei der Oligo- und Polynukleotidsequenzierung und –synthese

wendet.

4.

Die Aufgabe wird nach Streitpatent gelöst durch die Bereitstellung von

Nukleotiden mit speziellen Schutzgruppen für die 3'-Position der Riboseeinheit

gemäß der

in Patentanspruch 1 angegebenen und nachfolgend gegliederten

generischen Struktur (die Konkordanz zu den Gliederungspunkten der Parteien

findet sich in eckigen Klammern und grau in der ersten Spalte):

Merkmal 1 [1-1.2]

Englisch A modified nucleotide molekule comprising a purine or pyrimidine base and a ribose or deoxyribose sugar moiety having

Deutsch

Modifiziertes Nukleotidmolekül umfassend eine Purin- oder Pyrimidinbase und eine Ribose- oder Desoxyribose-Zuckereinheit, mit einer

2 [1.3- 1.3.1]

2.1 [1.3.2]

2.1a [1.3.3]

2.1b [1.3.5]

2.1c [1.3.5.1]

a removable 3’-OH blocking group covalently attached thereto, such that the 3’ carbon atom has attached a group of the structure -O-Z

kovalent daran gebundenen, entfernbaren, 3’-OH-blockierenden Gruppe, so dass an dem 3’-Kohlenstoffatom eine Gruppe der Struktur -O-Z gebunden ist,

wherein Z is any of -C(R’)2- N(R’’)2, -C(R’)2-N(H)R’’, -C(R’)2- N3 wherein each R’’ is or is part of a removable protecting group;

wherein said molecule may be reacted to yield an intermediate in which each R’’ is exchanged for H, which intermediate dissociates under aqueous conditions to afford a molecule with a free 3’OH

wobei es sich bei Z um eines von -C(R’)2-N(R’’)2, -C(R’)2-N(H)R’’, -C(R’)2-N3 handelt, wobei es sich bei jedem R’’ um eine entfernbare Schutzgruppe oder einen Teil davon handelt; wobei das Molekül umgesetzt werden kann, um ein Zwischenprodukt zu ergeben, bei welchem jeder R’’ gegen H ausgetauscht ist, wobei dieses Zwischenprodukt unter wässrigen Bedingungen dissoziiert, um ein Molekül mit einem freien 3’-OH hervorzubringen.

2.1d [1.3.4] [1.3.4b]

(wherein) each R’ is independently a hydrogen atom, an alkyl, substituted alkyl, arylalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, heterocyclic, acyl, cyano, alkoxy, aryloxy, heteroaryloxy, or amido group, or a detectable label attached through a linking group; or (R’)2 represents an alkylidene group of formula =C(R’’’)2 wherein R’’’ may be the same or different and is selected from the group comprising hydrogen and halogen atoms and alkyl groups.

(wobei) es sich bei jedem R’ unabhängig um ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-, substituierte Alkyl-, Arylalkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Heteroaryl-, heterozyklische, Acyl-, Cyano-, Alkoxy-, Aryloxy-, Heteroaryloxy- oder Amido-Gruppe oder eine durch eine verknüpfende Gruppe gebundene nachweisbare Markierung handelt; oder (R’)2 eine Alkylidengruppe der Formel =C(R’’’)2 darstellt, wobei jeder R’’’ gleich oder unterschiedlich sein kann und aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend Wasserstoff- und Halogenatome und Alkylgruppen.

Die Diskussion der Parteien beschränkt sich ausschließlich auf Nukleotide mit

einer 3’-Azidomethyloxygruppe bzw. einer 3’-Azidomethylgruppe als Schutzgruppe

für die 3’-OH-Funktion (Merkmale 2, 2.1 und 2.1d, Z = -C(R’)2-N3 mit R’ = H).

Die zueinander in Nebenordnung stehenden Patentansprüche 12, 17, 25 und 28

bis 30 bleiben ungegliedert. Im Einzelnen ist von diesen Patentanspruch 12 auf

Verfahren zum kontrollierten Einbau eines nach Patentanspruch 6 bis 10

markierten, zu einem zweiten Nukleotid

in diesem einzelsträngigen Ziel-

Polynukleotid

komplementären Nukleotids

bei

einer Synthese-

oder

Sequenzierreaktion gerichtet, wobei der Einbau den darauffolgenden Einbau

(komplementärer) Nukleosid- oder Nukleotidmoleküle verhindert oder blockiert,

während Patentanspruch 17 ein Verfahren zur Sequenzbestimmung eines

einzelsträngigen Ziel-Polynukleotids

durch Überwachung

des Einbaus

aufeinanderfolgender nach Patentanspruch 6 bis 10 markierter Nukleotide betrifft,

bei welchem die Identität des Nukleotids anhand der Markierung bestimmt wird

und blockierende Gruppe und Markierung vor Einführung des nächsten Nukleotids

entfernt werden. Die Patentansprüche 25, 29 und 30 sind auf ein Kit mit nach den

Patentansprüchen 6 bis 10 markierten Nukleotiden und Verpackungsmaterialien

dafür gerichtet, sowie auf Oligonukleotide und Nukleotidtriphosphate mit einem

modifizierten Nukleotid nach den Patentansprüchen 1 bis 11; Patentanspruch 28

beansprucht die Verwendung eines modifizierten Nukleotids nach den

Patentansprüchen 1

bis

in Sanger-

oder

in Sanger-ähnlichen

Sequenzierverfahren.

5.

Einige Merkmale der zulässig erteilten und insoweit nicht angegriffenen

Patentansprüche bedürfen näherer Betrachtung.

5.1 Den Kern der Erfindung bilden Nukleotide mit der Gruppe -O-Z, die im Teil Z

u.a. eine C(R’)2-Gruppe (2.1) mit weitgehend beliebigen Resten R’ (2.1d)

beinhaltet. Weitere Unterschiede in der -O-Z-Gruppe entstehen durch die an die

C(R’)2-Gruppe gebundenen N(R’’)2-, N(H)R’’- und N3-Gruppen (2.1). Nach dem

Anspruchswortlaut beziehen sich die Merkmale 2.1a-c nur auf solche Gruppen mit

einem nach Merkmal 2.1a gleichermaßen als Schutzgruppe bezeichneten R’’-

Rest.

Allerdings stellt Absatz [0117] mit dem darüber gesetzten Titel im Streitpatent klar,

dass auch die Azidomethylgruppe die geschützte Form eines unter wässrigen

Bedingungen dissoziierenden Hemiaminals als Zwischenprodukt darstellt (3’-OH

protected with an azidomethyl group as a protected form of a hemiaminal), ebenso

wie die anderen geschützten Gruppen -C(R’)2-N(R’’)2 (NiK1 Fig. 3). Daher kann

auch der an der fachlichen Lehre der NiK1 vorbeigehenden Einwand der Klägerin,

dass die Merkmale 2.1a, 2.1b und 2.1c vom Azidomethylrest nicht erfüllt würden

und dieses insoweit fakultativ keinen festen Bestandteil der technischen Lehre

bilde, nicht überzeugen.

5.2 Bei den beanspruchten unterschiedlichen Arten der Markierung nach

Merkmal 2.1d kann es sich um eine durch eine verknüpfende Gruppe gebundene

nachweisbare und ggf. spaltbare Markierung als Rest R’ handeln (NiK1

Patentansprüche 1, 8). Zudem kann die Base nach Merkmal 1 über einen ggf.

spaltbaren Linker mit einer nachweisbaren Markierung verknüpft sein (NiK1

Patentansprüche 1, 6). Insoweit erfolgt der Einsatz der Nukleotide im Sanger-

Sequenzierverfahren oder Sequenzierverfahren der Sanger-Art wahlweise

markiert

oder

unmarkiert

(NiK1

Patentanspruch 28), während

die

Patentansprüche 12, 17 und 25 nach NiK1, welche auf ein Kit, einen kontrollierten

Nukleotideinbau und ein Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidsequenz

gerichtet sind, zwingend über die Base markierte Nukleotide

fordern.

Patentanspruch 12

beansprucht

die

kontrollierten

Synthese-

und

Sequenzierreaktionen als gleichrangig und betrifft daher auch reine DNA-

Syntheseverfahren, bei denen die Sequenz des entstehenden Polynukleotids

komplementär zur Sequenz eines „einzelsträngigen Ziel-Polynukleotids“ ist.

II.

Entgegen der Ansicht der Klägerin erweisen sich die Gegenstände aller

nebengeordneten Patentansprüche des Streitpatents, getragen durch den

Stoffanspruch 1, als durch den Stand der Technik nicht nahegelegt.

Auch wenn

sich dem Streitpatent

keine besonderen Vorteile der

Azidomethylgruppe gegenüber anderen, bekannten Nukleotid-Schutzgruppen

entnehmen lassen, ist es nicht auf die Herstellung der erfindungsgemäßen

Nukleotide und deren Bereitstellung als Stoffe „per se“ gerichtet, sondern stellt

diese in einen Rahmen hinsichtlich ihrer Eignung bei der DNA-Sequenzierung

durch DNA-Synthese (NiK1 [0004]), insbesondere stellt das Streitpatent darauf ab,

dass diese unter DNA-kompatiblen Bedingungen entfernt werden können (NiK1

[0011] und [0013]). Dass für die erfindungsgemäßen Verbindungen auch andere

Einsatzmöglichkeiten beansprucht sind, verändert ihr Eigenschaftsprofil

insoweit

nicht.

Dass der Fachmann vor dem Hintergrund geläufiger Schutzgruppen und

schonender Möglichkeiten zu deren Entfernung veranlasst sein konnte, nach

weiteren Schutzgruppen für das SBS-Verfahren und andere Sequenzier- bzw.

Syntheseverfahren zu suchen, ist seinem allgemeinen Bestreben, bestehende

Technologien zu verbessern, zuzurechnen und wird daher unterstellt.

1.

Hinsichtlich des Einsatzes der erfindungsgemäßen Nukleotide im SBS-

Verfahren macht die Klägerin im Wesentlichen fehlende erfinderische Tätigkeit

gegenüber den Kombinationen NiK11 mit NiK26/27, NiK11 mit NK17 und NiK11

mit NiK16 geltend. In der mündlichen Verhandlung hat sie hierbei im Schwerpunkt

auf die Kombination von NiK11 mit NiK26/27 abgestellt.

1.1 Die Lehre der NiK11 befasst sich im Rahmen des SBS-Verfahrens mit bei

einzelnen bekannten Schutzgruppen auftretenden Nachteilen und benennt

entsprechende Lösungen. Geeignete Schutzgruppen würden dabei durch zwei

Kriterien bestimmt; zum einen, dass die Schutzgruppe vom Enzym akzeptiert wird,

und zum anderen, dass eine milde Entschützung in einer nicht die DNAschädigenden Weise gelingt. So sei das SBS-Verfahren nur mäßig erfolgreich

gewesen, wenn in 3’-Position der Ribose sterisch anspruchsvolle Schutzgruppen

vorgelegen hätten, ein Nachteil, dem durch gentechnisch veränderte Polymerase

begegnet werden könne (NiK11 S. 4 Z. 15-31). Für den Einsatz üblicher

Polymerasen empfiehlt NiK11 die Bindung der Markierung an die Base (NiK11

S. 5 Z. 5-19) und „kleine“ leicht abspaltbare Gruppen zum Schutz der 3’-OH-

Gruppe (NiK11 S. 5 Z. 26-29). Dem Größenbereich „klein“ zugeordnet werden die

Gruppen Methyl, MOM (Methoxymethyl) und Allyl (NiK11 S. 5 Z. 29 - S. 6 Z. 6 und

14-17; S. 20 Z. 21-24), von denen die 3’-Methoxygruppe wegen der im Vergleich

zu Allyl oder MOM drastischen und wasserfreien Spaltungsbedingungen als für

SBS ungeeignet ausgewiesen wird (NiK11 S. 6 Z. 2-6). Ausdrücklich rät NiK11

vom Einsatz elektrophiler Schutzgruppen wie Estern und Ketonen ab, da diese

durch starke Nukleophile im aktiven Zentrum der Polymerase nahe der 3’-

Substituenten gespalten würden (NiK11 S. 6 Z. 6-14). Unter Nukleophilen werden

gemeinhin Anionen bzw. anionische Gruppen oder neutrale Moleküle mit „freien“

Elektronenpaaren verstanden. Schutzgruppen nach den Merkmalen 2.1 sind in

NiK11 nicht angesprochen. Aus fachlicher Sicht vermittelt die der NiK11 zu

entnehmende Angabe, dass für das SBS-Verfahren geeignete Nukleotid-Analoga

strukturell und funktional den natürlichen Nukleotiden ähnlich genug sein müssten,

auch zusammen mit den dort nur als Beispiele für „kleine“ leicht abspaltbare

Gruppen genannten Gruppen MOM und Allyl kein stringentes Auswahlkriterium

(NiK11 S. 20 Z. 1-4 und 21-24). Gleichwohl erschließt sich ein auf die Gruppen

MOM und Allyl gerichteter Fokus als mögliche Vorauswahl, bei welcher der

Fachmann

jedoch

ohne weiteres erkennt, dass

es sich bei diesen

Etherschutzgruppen um wenig polare Alkenyl- oder Alkoxyalkyl-Schutzgruppen

handelt und dass diese unsubstituierten Ether nukleophilen Angriffen eher nicht

zugänglich sind.

Da NiK11 Schutzgruppentypen mit Elektrophilen wie Estern oder Ketonen als für

SBS ungeeignet ausweist (NiK11 S. 6 Z. 11 not suitable), ergibt sich von dieser

Erkenntnisquelle

ausgehend

keine

fachlich

begründete

Veranlassung,

Schutzgruppentypen mit Elektrophilen aufzugreifen und aufgabengemäß

einzusetzen.

Entgegen dem Vortrag der Klägerin war der Fachmann auch nicht veranlasst, das

Auftreten von „starken Nukleophilen“ im aktiven Zentrum der Polymerase in

Zweifel zu ziehen oder im Einzelnen zu untersuchen. Hierzu hat die Klägerin

ausgeführt, dass der Fachmann unter Berücksichtigung dieses Hinweises in

NiK11 überlegt hätte, welche Gruppierungen als Nukleophile überhaupt in Frage

kommen könnten. Da Polymerase nicht nukleophile Metallionen wie Magnesium

enthalte, kämen als Nukleophile nur Gruppierungen auf den Seitenketten der

Aminosäuren in Betracht, die in die Nähe der 3‘-OH-Schutzgruppe des Nukleotids

gelangen könnten. Dies beschränke die Auswahl an möglichen nukleophilen

Gruppen auf wenige konkrete Beispiele, wie die Aminogruppe bzw.

Guanidinogruppe aus der Seitenkette von Lysin oder Arginin, oder die

Carboxylgruppe von Aminosäuren wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure. Ein

Chemiestudent wisse, dass eine Keton-Gruppierung von einer Amino- oder

Carboxylgruppe nukleophil angegriffen werden könne, so dass der Fachmann

Schutzgruppen mit Elektrophilen, bei denen aufgrund allgemeinen Fachwissens

kein nukleophiler Angriff durch die genannten Carboxyl- oder Aminofunktionen in

den Seitenketten der Polymerase zu befürchten stand, als Kandidaten für die SBS

berücksichtigt hätte.

Zwar kann den Ausführungen der Klägerin dahingehend gefolgt werden, dass dem

in Figur 1 der NiK11 gezeigten Teilauschnitt des aktiven Zentrums einer

bestimmten Polymerase zufolge (NiK11 S. 13 Beschreibung zu Fig. 1) die

Carboxylatreste von Asparaginsäuren (Bz. 190, 192 und 256) nahe eines

Magnesiumatoms liegen. Ebenso ist ihr beizupflichten, dass Metallkationen wie

Mg2+ nicht nukleophil zu reagieren vermögen. Zur Rolle von Aminogruppen als

mögliche „starke Nukleophile“ trifft NiK11 hingegen keine Aussage.

Carboxylatanionen sind

jedenfalls nicht nukleophil genug, um Ester oder

Ketongruppen anzugreifen. Denn Carboxylate stellen selbst ein weitgehend

reaktionsträges Produkt der alkalischen Hydrolyse von Estern dar. Gegen den

nicht weiter belegten Vortrag der Klägerin in der mündlichen Verhandlung, eine

Ketongruppe werde von einer Carboxylatgruppe nukleophil angegriffen, weil

Carboxylate die Umesterung katalysierten, spricht schon das allgemeine

Grundwissen des organischen Chemikers im fachmännischen Team, dass eine

Umesterung entweder im sauren Medium erfolgt, in dem keine Carboxylate,

sondern wenig nukleophile Carbonsäuren vorliegen, oder im stark alkalischen

Medium, in dem Alkoholate, nicht aber Carboxylate diese Reaktion ermöglichen.

Damit führen die der NiK11 zu entnehmenden Angaben zur Struktur des

Polymerasezentrums lediglich zu dem Schluss, dass die „starken Nukleophile“

durch dort nicht näher spezifizierte Mechanismen gebildet werden und jedenfalls

eine Spaltung von Estern bewirken. Eine andere Bewertung ist auch nicht dadurch

veranlasst, dass NiK11, wie die Klägerin anmerkt, auf NiK20 verweist (NiK11 S. 6

Z. 10). Die NiK20 befasst sich zwar mit der nukleophilen Wirkung von

Asparaginsäuren im aktiven Zentrum der Polymerase, allerdings ohne zu

endgültigen Ergebnissen zu kommen (NiK20 S. 10859 li. Sp. le. Abs. – re. Sp.

Satzende), und lässt – ebenso wie NiK11 – die Art der „starken Nukleophile“ offen

(NiK20, S. 10863 li. Sp. Abs. 2 ab Z. 10).

1.2 Auch wenn der Fachmann aufgrund seines von der Klägerin durch mehrere

Druckschriften gutachtlich belegten Wissens um die Ähnlichkeit von Nukleosiden

und Nukleotiden für den Einsatz bei Sequenzierverfahren und der auch im

Streitpatent verwirklichten gängigen Synthese von Nukleotiden aus Nukleosiden

(NiK1 [0143] und [0144]) die in den Druckschriften NiK26/27 angegebenen

Nukleosidschutzgruppen für das SBS-Verfahren in Betracht gezogen hätte, führt

ihn die Zusammenschau dieser Druckschriften ebenfalls nicht auf den

erfindungsgemäßen Weg.

Beide wissenschaftlichen Artikel NiK26/27 stehen in Beziehung zueinander, da

NiK27 auf die Lehre der NiK26 Bezug nimmt und daran anknüpft (NiK27, Lit.-Ref.

Nr. 5). NiK26 zeigt ein

einziges Reaktionsschema mit 21 möglichen

Schutzgruppen (NiK26 S. 7594 Reste X) und weiteren Schutzgruppen bei den dort

gezeigten Ausgangsverbindungen 1 bis 3. Ausgehend von NiK11 hatte der

Fachmann, wie ausgeführt, keinen Anlass aus diesem Kollektiv gerade eine

Blockiergruppe mit Elektrophilen auszuwählen. Insoweit kommt es, wie die

Beklagte zutreffend einwendet, auf weitere Erwägungen, die über das

hinausgingen, was der Fachmann routinemäßig leiste, nicht an.

Werden gleichwohl die Ausführungen der Klägerin zur unterschiedlichen

Reaktivität von Elektrophil-Nukleophil-Paaren zum Gegenstand der Betrachtung

gemacht, kann die Reaktivität solcher Paare dann abgeschätzt werden, wenn

beide Reaktionspartner unter ähnlichen Reaktionsbedingungen verglichen

werden.

Insoweit entnimmt der Fachmann NiK26/NiK27 die Lehre der Entfernung einer

Azidomethylgruppe als eine von dort zumindest 21 verschiedenen beschriebenen

Schutzgruppen für Nukleoside unter milden Bedingungen (NiK26 S. 7595 le. Satz;

NiK27 S. 1980 Abs. unter SCHEME 2) und erkennt, dass die Umsetzung mit

Triphenylphosphin in wässrigem Pyridin durchgeführt wird und damit in einem

protischen Lösungsmittel, mittels der ihm bekannten Staudinger-Reaktion. Bei

dieser Reaktion erfolgt ein initialer nukleophiler Angriff des Triphenylphosphins an

der elektrophilen Azidomethylgruppe, analog zum initialen nukleophilen Angriff des

Triphenylphosphins an der elektrophilen Ketongruppe bei der Wittig-Reaktion

(NiK69 S. 438 ab etwa Seitenmitte), die fachbekannt auch in protischen

Lösungsmitteln durchgeführt werden kann, wenngleich aprotische Lösungsmittel

bevorzugt sind. Folglich sind sowohl die Azidgruppe als auch die Ketongruppe,

von der in NiK11 abgeraten wird, einem Angriff durch dasselbe Nukleophil

Triphenylphosphin zugänglich. Das Lehrbuch NiK68 führt ergänzend aus, dass

eine Estergruppe wie Ethoxycarbonyl von Triphenylphosphin in der Staudinger-

Reaktion nicht angegriffen wird (NiK68 S. 760 le. Abs. - S. 761, nach Informations-

Kasten Staudinger-Reaktion), was zum Ergebnis führt, dass die Keton- und

Azidgruppe durch das Nukleophil Triphenylphosphin angegriffen werden, eine

Estergruppe jedoch nicht. Diese wird vielmehr durch die „starken“ Nukleophile im

Polymerase-Zentrum nach NiK11 nukleophil gespalten, welche somit stärker

nukleophil wirken als Triphenylphosphin.

Gegen die hierzu vorgebrachten Argumente der Klägerin, dass Triphenylphosphin

bei der Staudinger- und der Wittig-Reaktion auch reduzierend wirke, dass diese

Verbindung in der Polymerase nicht vorhanden sei und dass die Entschützung in

einem anderen Medium ablaufe als die Enzymreaktion, spricht bereits, dass

Folgereaktionen und tatsächlich in der Polymerase wirkende Nukleophile bei einer

kursorischen Reaktivitätsbetrachtung von funktionellen Gruppen unbeachtlich

sind. Selbst die Klägerin bestreitet nicht, dass, sofern der Fachmann Elektrophile

ohne Carbonylfunktion in Betracht gezogen hätte, er nur solche darunter fassen

würde,

die zumindest eine

ähnliche elektrophile Reaktivität wie die

Carbonylfunktion innerhalb einer Keto- oder Estergruppe aufweisen. Dies ist

gegenüber dem Nukleophil Triphenylphosphin zweifelsfrei erfüllt.

Nicht zuletzt hätte er auch von den in NiK26/27 genannten Bedingungen zur

Entschützung schon deswegen Abstand genommen, weil er mit stöchiometrisch

einzusetzendem und schwer abtrennbarem Triphenylphosphin und toxikologisch

bedenklichem Pyridin als Lösungsmittel hätte arbeiten müssen, und dies

angesichts eines Standes der Technik, der kostengünstige katalytische Verfahren

und einfach zu handhabende Reagenzien

für die Entfernung von 3’-

Schutzgruppen bereit hält. Die zwischen den Parteien insoweit diskutierten

Fragen, ob die „milde Entschützung“ der NiK26/27 nur auf den Zusammenhang

mit Synthonen in der organischen Synthese abstellt oder ob Pyridin in höheren

Konzentration denaturierend oder gar zerstörend auf DNA wirkt und schon

deswegen keinen diesbezüglichen Einsatz anregen kann, können somit

unbeantwortet bleiben.

Zieht der Fachmann auf der Suche nach Alternativen zu den in NiK11 genannten

Schutzgruppen das Kompendium NiK17 heran, um einen Überblick über

Schutzgruppen

für

die

3'-OH-Position

der

(Desoxy)Ribose

in

Nukleosiden/Nukleotiden zu bekommen, führt dieses geeignete Schutzgruppen für

aliphatische und aromatische Alkohole

jeweils separat auf, wobei die

„Leitstrukturen“ Allyl und MOM als für beide Arten von Hydroxylgruppen geeignet

angegeben sind (NiK17 S. 27-33 und 67-74; S. 257-259 und 262-264). Die

Azidomethylschutzgruppe ist in NiK17 dagegen ausschließlich als Schutzgruppe

für aromatische Alkohole genannt (NiK17 S. 260). Somit wird der Fachmann von

NiK11 ausgehend lediglich dann auf diese Schutzgruppe stoßen, wenn er dort

genannte Schutzgruppen sowohl für aromatische als auch für aliphatische

Hydroxylgruppen als gleichermaßen geeignet in Betracht zieht. Ein Anlass hierfür

ist allerdings nicht ersichtlich. Denn NiK17 gibt zwar an, dass viele Schutzgruppen

für alkoholische Hydroxylgruppen und für aromatische Hydroxylgruppen tauglich

sein können

(NiK17 S. 248 Mitte 3. Satz), es

findet sich

jedoch kein

entsprechender umgekehrter Hinweis. Da die Azidomethylgruppe allein als

Aryloxyschutzgruppe ausgewiesen wird, während viele andere Schutzgruppen als

für beide Arten Hydroxylgruppen geeignet aufgelistet sind, vermögen

Spekulationen der Klägerin über die Gründe dieser separaten Darstellung oder

ihre Einlassung, dass diese Schutzgruppen für Arylalkohole „nicht als prinzipiell

untauglich“ anzusehen seien, nichts am Fehlen eines Hinweises in NiK17 auf die

Azidomethylschutzgruppe bei aliphatischen Hydroxylgruppen zu ändern.

Wie schon bei der Kombination von NiK11 mit NiK26/27 angesprochen, stellt der

Azidteil der Azidomethylgruppe eine elektrophile Gruppe dar, was auch in NiK17

dadurch untermauert wird, dass er dem Angriff von ausschließlich als Nukleophil

wirkenden Hydriden in Form von Lithiumaluminiumhydrid zugänglich ist (NiK17

S. 260 Z. 7). Somit hat der Fachmann im Lichte der Informationen aus NiK11 beim

Einsatz dieser Schutzgruppe gleichermaßen einen Angriff durch die im Zentrum

der Polymerase befindlichen Nukleophile zu befürchten. Weiter erfolgt die

Entschützung der Azidomethylgruppe den Angaben der NiK17 zufolge entweder

mit dem genannten Lithiumaluminiumhydrid unter wasserfreien Bedingungen und

damit unter Bedingungen, von denen die NiK11 explizit abrät (NiK11 S. 6 Z. 2-10),

oder durch katalytische Hydrogenolyse mit Palladium auf Kohlenstoff, die nach

den Angaben aus der Literatur zu einer Reduktion der Pyrimidinbasen führt (rop6

S. 3400 spaltenübergr. Abs.). Darüberhinaus ist eine mit einem geträgerten

Katalysator durchzuführende Hydrogenolyse bei gleichzeitiger Trägerung der

Polynukleotide nicht möglich, da die Reaktanten nicht in Kontakt kommen und sich

nur mit erheblichem Aufwand voneinander trennen lassen; bei einem alternativem

Einsatz nicht geträgerter Polynukleotide wird deren Reinigung ebenfalls unnötig

verkompliziert.

Der Behauptung der Klägerin, dass die Azidomethylgruppe anders als eine

Estergruppe nicht empfindlich für einen nukleophilen Angriff aus dem Zentrum der

Polymerase und ohnehin um mehrere Bindungslängen von diesem entfernt sei,

fehlt nach den obigen Ausführungen jede Untermauerung aus dem Stand der

Technik. An keiner Stelle findet sich ein röntgenographischer Nachweis zur

räumlichen Struktur des aktiven Polymerase-Zentrums mit Anordnung von

geschützten Nukleotiden darin. Ihr Einwand, dass es nach der bereits oben

diskutierten NiK20 auf die Position und den Abstand des elektrophilen Atoms von

der Ribose-Zuckereinheit ankomme, um für einen nukleophilen Angriff von

Gruppierungen im katalytischen Zentrum der Polymerase überhaupt empfänglich

zu sein (NiK20 S. 10863 Ii. Sp. 7.-5.-le. Z.), scheitert bereits daran, dass die

Zwischenstufe der Staudinger-Reaktion und damit der Angriff des

Triphenylphosphins an der Azidomethylgruppe nicht aufgeklärt sind. Unter

Berücksichtigung der Information aus NiK11, dass das aktive Zentrum der

Polymerase räumlich beengt ist (NiK11 S. 4 Z. 31 - S. 5 Z. 3, S. 13 Z. 8-11 very

crowded), ist schließlich auch zu bedenken, dass die Azidomethylgruppe wegen

des stäbchenförmigen und von der Klägerin als „starr“ bezeichneten Azidteils

länger und sperriger ist als die MOM- und Allyl-Gruppe. Wesentlich und nicht zu

vernachlässigen ist dabei die hohe Polarität der Azidgruppe im Vergleich zu den

Leitstrukturen der MOM- und Allyl-Gruppe, die sich fraglos auf die Anordnung der

Substituenten im Zentrum der Polymerase auswirkt (NiK11 Fig. 1 mit Ausrichtung

der polaren Carboxylat- und Phosphatgruppen zum Mg2+-Atom hin).

Aus den genannten Gründen vermag die Kombination der durch NiK11

vermittelten Lehre mit entweder NiK26/27 oder NiK17 keine Anregung

dahingehend zu vermitteln, die Azidomethylgruppe als nachgewiesen elektrophile

Schutzgruppe aus den

umfangreichen Kollektiven

der dort gezeigten

Schutzgruppen auszuwählen. Auf die nach den

in NiK17 oder NiK26/27

angeführten Methoden erzielbaren Ausbeuten bei der Reduktion der

Azidomethylgruppe kommt es somit nicht an.

1.3 Keine andere Bewertung ergibt sich für die Kombination der Lehren von

NiK11 mit NiK16, die auf die Staudinger-Reaktion bei einem durch organische

Synthese gewonnenen Dinukleotid mit direkt gebundener Azidgruppe gerichtet ist.

Weder sitzt die Azidgruppe in der 3’-Position der Desoxyribose, sondern in deren

2’-Position,

noch gelangt man durch deren Reduktion zu einer 3’-

Hydroxyverbindung, sondern zu einer 3’-Aminoverbindung, also nicht einmal zu

einer

nach NiK11

zu

schützenden

3’-OH-Gruppe

(NiK16 S. 3228

Reaktionsschema). Für ein Verständnis in Richtung Polynukleotidsynthese mittels

SBS-Verfahren oder in Richtung der 3’-Azidomethylschutzgruppe an der 3’-OH-

Gruppe fehlt dieser Kombination jedweder Anhaltspunkt.

1.4 Die von der Klägerin im Zusammenhang mit der Druckschrift NiK11 als

möglicher Ausgangspunkt begleitend diskutierte NiK10 beschreibt ebenfalls 3'-

geschützte Nukleotide für das SBS-Verfahren. Allerdings ist dort eine Vielzahl

potentiell geeigneter Blockiergruppen wie Ester, Ether, Phosphat, Carbonat

(NiK10 S. 21 Z. 20-26) genannt, neben speziellen selektiv chemisch zu

entschützenden Blockiergruppen wie 2,4-Dinitrobenzolsulfenyl (NiK10, S. 21 Z. 27

und Bsp. 5), Allyl- und Tetrahydrothiofuranyl (NiK10 S. 21 Z. 27, S. 24 Z. 29 -

S. 25 Z. 3) oder solchen Gruppen, die photochemisch oder enzymatisch gespalten

werden (NiK10 S. 25 Z. 4-25 und Bsp. 6). Außer der im Beispiel behandelten 2,4-

Dinitrobenzolsulfenylgruppe wird keine der dort genannten Blockiergruppen in

besonderem Maße herausgestellt, wonach NiK10 als möglicher Ausgangspunkt in

der Offenbarung nicht über NiK11 hinausgeht. Ein Hinweis für den Fachmann auf

geeignete Blockiergruppen in Richtung der Lehre des Streitpatents geht aus

NiK10 ohnehin nicht hervor.

2. Mit Blick auf weitere Einsatzzwecke streitpatentgemäßer Nukleotide

außerhalb des SBS-Verfahrens zieht die Klägerin deren Verwendung als antivirale

Mittel,

bei der Sanger-Sequenzierung oder bei matrizenunabhängigen

Sequenzierverfahren in Betracht und sieht damit

eine ihrer Auffassung nach

ebenfalls überschaubare Anzahl geschützter Nukleoside/Nukleotide in den mit

diesen Anwendungen befassten Druckschriften NiK7, NiK12, NiK27, NiK46 und

NiK64 als nahe liegend an.

Auch ihre insoweit getätigten Ausführungen können die erfinderische Tätigkeit bei

den Gegenständen des Streitpatents nicht in Frage stellen.

2.1 Zugunsten der Klägerin kann angenommen werden, dass dem Fachmann

die Anwendung von 3’-substituierten Nukleotiden/Nukleosiden als antivirale

Wirkstoffe, ein Anwendungsbereich, der

im Streitpatent an keiner Stelle

angesprochen ist, aufgrund seines Fachwissens im Blick lag. Ein Anzeichen dafür

ist darin zu sehen, dass das Streitpatent und die dort zitierte NiK11 beide die

Druckschrift NiK7 zitieren (u.a. NiK1 [0007], NiK11 S. 3 Z. 23), die neben den

weiteren diesbezüglich von der Klägerin vorgelegten Druckschriften NiK27, NiK46

und NiK64 diese Anwendung zum Thema hat

(NiK7 S. 4259 Z. 5 unter

Introduction; NiK27 S. 1977 Z. 2 unter Introduction; NiK46 S. 741 Z. 6 unter

Introduction; NiK64 Überschrift). Diese Druckschriften mögen daher als vom

Fachwissen gestützte Ausgangspunkte für die Bereitstellung von insbesondere 3’-

substituierten Nukleosiden dienlich sein.

Hinsichtlich der nun zugrunde zu legenden Aufgabe der Bereitstellung von

antiviralen Mitteln ist dabei auch auf das Fachwissen des Fachmanns abzustellen,

demzufolge solche Mittel nur im nicht phosphorylierten Zustand wirken können,

mit anderen Worten als Nukleoside.

Aus der von der Klägerin präsentierten Auswahl an Druckschriften muss bereits

die NiK7 ausgenommen werden, die keine Azidomethyl-geschützten Nukleoside

offenbart. Azidomethyl-geschützte Nukleoside finden sich neben zahlreichen

Beispielen für Nukleoside mit anderen Schutzgruppen in NiK27, NiK46 und NiK64

(NiK27 S. 1981 Schema 3; NiK46 Tab. 1, 3, 5, 8; NiK64 S. 18 Tab. 1).

NiK27 gibt keine Anregung, die dort offenbarte Nukleosidchemie auch für

Nukleotide in Betracht zu ziehen, da Nukleotide, wie ausgeführt, nicht als antivirale

Mittel zu wirken vermögen. Soweit eine in NiK27 (oder auch NiK26) nicht einmal

angesprochende Möglichkeit erkennbar sein mag, dort gelistete Nukleoside durch

Phosphorylierung in Nukleotide umzuwandeln, vermitteln diese Schriften dem

Fachmann auch keine sinnvolle Anwendung im Sinne einer Anregung, diese

Phosphorylierung vorzunehmen. Insbesondere findet sich keine Motivation für die

Herstellung von 3'-O-Azidomethyl-Nukleotiden, denn beide Druckschriften stellen

im Kern auf vielseitig umwandelbare Methylthiomethyl-geschützte Nukleoside ab

und empfehlen, was den Azidomethylrest betrifft, dessen milde Reduktion, geben

jedoch

keinen

erkennbaren Hinweis

in Richtung

seiner

separaten

Weiterverwendung als antivirales Mittel. Damit kommt es auf durch das

Fachwissen des Synthesechemikers gestützte, aber erkennbar weitergehende

Überlegungen hinsichtlich der Erfolgsaussichten einer Phosphorylierung von

Azidomethylnukleosiden oder deren sich in einem weiteren Schritt anschließenden

etwaigen Testung auf Verhinderung des Zellwachstums nicht an.

Nichts anderes ergibt sich für NiK46 als Ausgangspunkt. Denn diese mit der

Untersuchung der Ribose-Ringkonformation und deren hydrolytischer Stabilität

befasste wissenschaftliche Publikation beschreibt zwar auch ein 3’-azidomethylsubstituiertes-2’,3’-Dideoxyribonukleosid, wobei dem Titel zufolge nur einige der

dort behandelten Verbindungen potentielle HIV-Inhibitoren bilden. Zudem lässt die

NiK46 offen, inwieweit Konformation oder Hydrolysestabilität ein Indiz für deren

gelungenen Einsatz als antivirale Mittel bilden. Von NiK46 ausgehend findet sich

für den Fachmann kein Hinweis, von dem dort behandelten Nukleosidkollektiv

speziell das Azidomethylderivat herauszugreifen und die bereits zu NiK26/NiK27

ausgeführten weiteren Überlegungen anzustellen.

Nicht zuletzt befasst sich auch die NiK64 mit der hydrolytischen Stabilität von

Nukleosiden, führt einleitend AZT, also ein 3’-Azidnukleosid als bekannten HIV-

Wirkstoff auf

(NiK64 S. 17 INTRODUCTION) und untersucht mögliche

Zusammenhänge zwischen Hydrolysestabilität und Wirkstoffeffizienz, allerdings

ohne konkrete Schlüsse zu präsentieren. Für den Fachmann beachtlich befindet

NiK64 jedoch, dass die Stabilität der untersuchten Nukleoside mit dem

elektronenziehenden Effekt (induktiver Sigma-Effekt) der Substituenten in der 3’-

Position korreliert. Daher wird er im Lichte des σ*-Wertes von 0,64 für den

Azidomethylrest, der weitab von dem Wert 0,87 für den stabileren Azidrest der

insoweit als bereits wirksam erkannten Verbindung AZT liegt (NiK64 S. 19 Abs. 2

und Tab. 2) gerade davon abgehalten, einem hydrolysempfindlicheren Rest aus

dem Kollektiv der dort genannten Verbindungen besondere Bedeutung

beizumessen und für den Verwendungszweck als antivirales Agens in Betracht zu

ziehen.

Als der NiK27 und der NiK46 vorausgehende Lehre führt der zahlenmäßig

erfasste Befund der NiK64

zur

vergleichsweise geringen Stabilität

azidomethylsubstituierter Nukleoside von deren Einsatz als antivirale Mittel weg.

2.2. Hinsichtlich des Verwendungszwecks der erfindungsgemäßen Nukleotide

im Sanger-Sequenzierverfahren sowie in Sequenzierverfahren der Sanger-Art

(NiK1 Anspr. 28) gelten dieselben Erwägungen.

Selbst wenn es dem Fachwissen des Fachmanns zuzurechnen sein mag, dass im

Zusammenhang mit antiviralen Mitteln vorgeschlagene 3‘-Azidomethylnukleoside

dem gleichen Wirkprinzip unterlägen wie die in den Sanger-Verfahren

verwendeten 3‘-geschützten Nukleotide, und selbst wenn NiK7 im Rahmen der

Einführung eine beträchtliche Breite an möglichen Kombinationen von

Terminatoren und Polymerasen für das Sanger-Verfahren anspricht (NiK7 S. 4259

INTRODUCTION

4. Satz),

belegen

die Versuche

der NiK7

eine

Terminierungsaktivität nur für einige der dort untersuchten Nukleotide (NiK7

S. 4263 Tab. 2). Eine Empfehlung oder ein Hinweis auf potentiell geeignete

Nukleotide außerhalb der spezifischen Offenbarung der NiK7 wird nicht gegeben,

insbesondere nicht für andere Anwendungsgebiete, wie sie in NiK27, NiK46 und

NiK64 beschrieben sind.

In keiner dieser Druckschriften

findet sich, wie

ausgeführt, eine erkennbare Qualifizierung des Azidomethylrests als besonders

geeignet für Sanger-Sequenzierverfahren bzw. Sequenzierverfahren der Sanger-

Art.

2.3 Was matrizenunabhängige Sequenzierverfahren betrifft, beschreibt die

insoweit von der Klägerin angeführte NiK12 die Herstellung von einzelsträngigen

Oligonukleotiden,

indem zwischen

jeweils zwei Nukleotiden mittels einer

matrizenunabhängigen Polymerase eine Phosphodiester-Bindung bewirkt wird.

Damit auf diese Weise in einem Verfahrenszyklus jeweils nur ein Nukleotid an den

bestehenden Strang angehängt wird, kommen Nukleotidanaloga zum Einsatz, die

an der 3'-Position der Ribose eine entfernbare Schutzgruppe aufweisen (NiK12

Sp. 4 Z. 12-48). Als geeignete Schutzgruppen listet NiK12 eine Vielzahl von

Schutzgruppen auf, nämlich Carbonitrile, Phosphate, Carbonate, Carbamate,

Ester, Ether, Borate, Nitrate, Zucker, Phosphoramidate, Phenylsulfenate, Sulfate

und Sulfone (NiK12 Sp. 4 Z. 64-67). Soweit die Klägerin eingewendet hat, dass in

NiK12 nur zehn Nukleotide konkret benannt seien und Ester als nachteilig

bezeichnet würden, was den Fachmann dazu brächte, sich vornehmlich der

Untersuchung substituierter Ether zuzuwenden, vernachlässigt sie, dass NiK12

eine

breite Aufstellung

von Schutzgruppentypen mit unterschiedlichem

Hydrolyseverhalten aufzeigt und dies den Fachmann gerade nicht dazu anhält, nur

in den Beispielen untersuchte Verbindungen

in Betracht zu ziehen.

Gleichermaßen führt die Kombination von NiK12 mit NiK17 oder NiK26/27 nicht

zur Auswahl einer Azidomethyl-Schutzgruppe, da weder NiK17 noch NiK26/27 ein

Hinweis zu entnehmen ist, der die Azidomethylgruppe als für diesen Zweck

besonders geeignet ausweisen würde.

2.4 Die übrigen von der Klägerin angeführten Entgegenhaltungen geben

entweder das Fachwissen des Fachmanns wieder oder unterscheiden sich noch in

weiteren Merkmalen von den patentgemäßen Gegenständen. Sie führen zu keiner

anderen Beurteilung der Sachlage. Keines der als Stand der Technik beachtlichen

Dokumente geht über den Offenbarungsgehalt der vorstehend diskutierten

Druckschriften hinaus oder bietet spezielle weitergehende Anregungen, die

entweder in Richtung der erfindungsgemäßen Azidomethyl-Nukleotide weisen

oder zur Aufklärung der „starken“ Nukleophile im Zentrum der Polymerase

beitragen und ggf. Zweifel an der Lehre der NiK11 wecken könnten. Schließlich

sind die übrigen Dokumente von der Klägerin auch nicht

im Einzelnen zur

Begründung mangelnder Patentfähigkeit herangezogen worden.

III.

Die Kostenentscheidung beruht auf § 84 Abs. 2 PatG i. V. m. § 91 Abs. 1 ZPO, die

Entscheidung über die vorläufige Vollstreckbarkeit auf § 99 Abs. 1 PatG i. V. m.

§ 709 ZPO.

IV.

Gegen dieses Urteil ist das Rechtsmittel der Berufung gegeben.

Die Berufungsschrift muss von einer in der Bundesrepublik Deutschland zugelassenen Rechtsanwältin oder Patentanwältin oder von einem in der Bundesrepublik

Deutschland zugelassenen Rechtsanwalt oder Patentanwalt unterzeichnet und

innerhalb

eines Monats

beim Bundesgerichtshof, Herrenstraße 45a,

76133 Karlsruhe eingereicht werden. Die Berufungsfrist beginnt mit der Zustellung

des in vollständiger Form abgefassten Urteils, spätestens aber mit dem Ablauf von

fünf Monaten nach der Verkündung.

Die Berufungsschrift muss die Bezeichnung des Urteils, gegen das die Berufung

gerichtet wird, sowie die Erklärung enthalten, dass gegen dieses Urteil Berufung

eingelegt werde.

Schramm

Schwarz

Münzberg

Jäger

Freudenreich